(1)试剂的制备：氯化乙酰甲胆碱用生理盐水稀释，按浓度0.03mg/ml-16mg/ml，倍倍递增稀释，4℃保存备用。用前需在室温下放置30min。
(2)准备好试验用仪器、设备和抢救用设备、药品。受试者试验前停用支气管扩张药，茶碱类、β2-受体兴奋剂或抗胆碱药物停用12h，抗组胺药物停用48h，皮质激素口服停用24h，吸入治疗停用12h。
(3)受试者戴有孔面罩，并与雾化器出口衔接，雾化器的入口应与压缩空气泵或氧气瓶衔接，气源压力为3.5kgf/cm2，流量为5L/min-7L/min。
(5)在雾化器内盛入5ml生理盐水雾化，潮气呼吸，吸入生理盐水2min停止。测FEV1并与基础值比较，降低不到10%，继续进行药物试验，如果降低10%以上，休息5min再吸入生理盐水，重测FEV1，如结果与上次相同，表明稀释剂本身可增加气道反应性，不再进行药物试验。
(6)药物试验：如果吸入生理盐水气道无反应，则从最低浓度开始顺次吸入乙酰甲胆碱，潮气呼吸，每一浓度吸2min，吸完后测FEV1等指标，直至FEV1较对照下降≥20%为止。
(2)采用Devibiss：N.40雾化器，对气溶胶排出量加以校准，每揿平均排放量0.003 ml。一次试验用五个雾化器，分别加入生理盐水和四级不同浓度的药液。乙酰甲胆碱浓度为：3.125、6.25、25、50mg/ml。
(4)雾化器口含管放置受试验者上、下牙齿之间，并戴鼻夹。先吸生理盐水，呼吸三次，由平静呼气末(功能残气位)开始缓缓吸气1s-2s至肺总量，屏气3s后呼气，吸气开始由试者手控雾化器皮球，给生理盐水一揿。
(5)按表顺序依次吸入药物(方法同上)，每一剂量吸完后，测FEV1指标，立即再吸下一剂量，直至FEV1较吸入生理盐水后FEV1降低20%或达到最高剂量，试验终止。吸入支气管扩张药物。
(7)绘制剂量反映曲线图，并在图中确定FEV1下降20%所需的药物浓度。 说明：纵坐标为FEV1 (%基础对照值)，横坐标为吸入药物浓度。a代表正常人曲线，b代表哮喘患者曲线。 结果判定 ： 以FEV1较基础对照值下降20%所需激发药物的浓度(PC20FEV1)或含量(PD20FEV1)来判定试验结果。乙酰甲胆碱PC20，FEV18mg/ml或PD20FEV112.8μmol为试验阳性，大于上述数值为试验阴性。
